Любителям генетики

09 АПРЕЛЯ 2021 СПЕЦПРОЕКТ: ЭПИГЕНЕТИКА Молекулы‌ ‌и‌ ‌эпигеном‌ ‌ 1732 0,0 0 13 ДОБАВИТЬ В ИЗБРАННОЕ print ОБЗОР Белки в комплексе с длинной некодирующей РНК навешивают метки на гистоны иллюстрация Михаила Гурьева АВТОР Наталья Кочанова Наталья Кочанова РЕДАКТОРЫ Антон Чугунов Антон Чугунов Андрей Панов Андрей Панов ТЕМЫ БИОЛОГИЯБИОТЕХНОЛОГИИГЕНЕТИКАДНКРНКСЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНКХРОМАТИНЭПИГЕНЕТИКА РЕЦЕНЗЕНТЫ Александр Литов Александр Литов Александра Галицына Александра Галицына Анастасия Ковина Анастасия Ковина Илья Флямер Илья Флямер Надежда Фурсова Надежда Фурсова Николай Золотарев Николай Золотарев Упоминаний об эпигенетике вы не встретите в школьном учебнике биологии, а ведь эта наука рассказывает, как клетка реализует свой генетический потенциал, «вылепливая» из одного и того же «теста» (последовательности ДНК) совершенно разные «пироги»: клетки эпителия, легкого, нервной ткани и многие другие. Эпигенетика изучает хроматин: ДНК и ассоциированные с ней РНК и белки, а также взаимодействия между ними. В этой статье, которой мы открываем спецпроект по эпигенетике, вы познакомитесь с основными игроками эпигенетики — молекулами хроматина. Много внимания мы уделим методам его изучения — для более глубокого понимания того, как ученые делают открытия в этой области. Эпигенетика Эпигенетика — с одной стороны, молодая и бурно развивающаяся наука. С другой стороны, в этой науке уже сложился фундамент основных понятий и концепций. Цель спецпроекта — рассказать об основных концепциях эпигенетики просто, но в то же время со всех сторон. Читатель узнает, какие молекулы и структуры стоят за передачей наследственной информацией и какими механизмами осуществляется эта передача. Часть контента позаимствована из блога автора Friends of Chromatin. «Диаэм» Генеральный партнер спецпроекта — компания «Диаэм». Это крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств. «СкайДжин» Партнер этой статьи — «СкайДжин». Пять причин выбрать SkyGen: Доступ к высококачественной продукции для молекулярной биологии. Высококвалифицированная научная поддержка. Быстрая логистика и складская программа. Удобное и взаимовыгодное сотрудничество. Адекватные цены. Дисклеймер Эта научно-популярная статья открывает цикл об эпигенетике и описывает, как молекулы взаимодействуют между собой, создавая эпигеном: молекулярную сеть, которая контролирует активность генов и обеспечивает передачу наследственной информации. Статья рассчитана на людей, которые готовы вспомнить школьный курс биологии, заинтересоваться и узнать много нового. Моя цель — показать, что происходит в современной эпигенетике, и на примере этой науки продемонстрировать, что научные картины и концепции в современной биологии можно представить и далекому от науки человеку, например, нарисовав схему происходящего. Мы рассмотрим современную модель вещества клеточного ядра — хроматина — и узнаем, как ученые думают и делают открытия в рамках этой модели, а также дополняют ее. Говоря о каждой модели, важно понимать, как ученые к ней пришли, поэтому значительное место отведено методам, каждый из которых вносит важный вклад в изучение модели хроматина. Для удобства чтения почти все наиболее важные методики собраны в этой — первой — публикации и вынесены в отдельную главу в конце статьи. В этой статье есть и краткое введение в строение молекул в живых клетках, но она не претендует на всеобъемлющее объяснение базовых принципов и ориентирована на читателя, знающего основы биохимии. Для подробного освоения биохимии автор рекомендует для начала обратиться, например, к книге Сергея Ястребова «От атомов к древу» [1], [2] и статьям с «Биомолекулы» [3], [4], а для более глубокого изучения — к учебнику по биохимии Ленинджера. Также в статье очень мало подробностей биотехнологии и генетической инженерии — только самые базовые вещи. Популярное объяснение этих процессов читатель сможет найти, например, в книге Александра Панчина «Сумма биотехнологии». К той же книге автор рекомендует обратиться для понимания того, как биология используется в нашем обществе и сможет использоваться в будущем. Краткое же знакомство с этими дисциплинами также возможно на «Биомолекуле» [3], [4]. Введение Молекулы и клеточное ядро По принятой биохимической классификации, в клетках есть молекулы четырех основных типов: нуклеиновые кислоты — дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая (РНК); белки; липиды [5]; углеводы . Об удивительных углеводах читайте спецпроект «Гликобиология». — Ред. Кроме этого, клетки наполнены молекулами меньшего размера, и даже атомами (например ионами). Они выполняют две основные функции: регуляторов для основных молекул (увеличивая или уменьшая их химическую активность) и «строительных блоков» для них. Роль «строителей» играют белки — например, они создают двухцепочечную молекулу ДНК из дезоксирибонуклеотидных остатков. Но и сами белки тоже нужно строить: они создаются специальными «машинами» из белков и РНК — рибосомами, где роль главного строителя играет уже РНК. Итак, молекулы большого размера состоят из меньших строительных блоков, которые часто состоят из еще меньших. ДНК состоит из дезоксирибонуклеотидных остатков, РНК — из рибонуклеотидных, белки — из аминокислот, углеводы — из моносахаридов (которые, кстати, входят и в состав нуклеотидов). Липиды довольно разнообразны и являются единственной химической категорией, которую классифицируют не по строению, а по свойствам: они не смешиваются с водой (на чем основан важный для молекулярной биологии гидрофобный эффект [6]). Клетки содержат органеллы (как бы очень маленькие клеточные органы). Клеточное ядро — одна из важнейших органелл (чаще всего оно шарообразное или в форме эллипсоида), отделенная ядерной оболочкой от остальной части клетки — цитоплазмы. В ядре происходит часть процессов, лежащих в основе «центральной догмы» молекулярной биологии: ДНК ⇆ РНК → белок (рис. 1). Центральная догма молекулярной биологии Рисунок 1. Центральная догма молекулярной биологии. Линейная последовательность ДНК переводится в сложный трехмерный белок через промежуточный продукт — РНК. Только часть этого процесса (транскрипция, или перевод ДНК в РНК) происходит в ядре. После этого РНК, если она кодирует белок (а может и не кодировать), переносится в цитоплазму и транслируется (переводится) в белок на рибосомах, причем каждые три нуклеотида кодируют одну аминокислоту. Рибосомная РНК синтезируется и начинает собираться вместе с другими белками в комплексы тоже в ядре. Интересно, что у некоторых вирусов и «прыгающих» элементов ДНК, в жизни которых есть стадия РНК, возможен обратный перевод РНК в ДНК (обратная транскрипция). Но обратного перевода белков в РНК пока не обнаружили. иллюстрация Михаила Гурьева ДНК и РНК ДНК состоит из нуклеотидных остатков. Они, в свою очередь, строятся из трех фрагментов: остатков сахара (дезоксирибозы), трифосфата и азотистых оснований. Несмотря на поразительную длину человеческой ДНК (3,2 миллиарда пар нуклеотидов в каждой клетке, что в развернутом состоянии даст два метра длины!), типов азотистых оснований всего четыре: аденин (А), тимин (Т), цитозин (Ц) и гуанин (Г). ДНК находится в двухцепочечном состоянии, где нуклеотиды одной цепочки образуют водородные связи с нуклеотидами другой. И действует строгое правило: аденин всегда выстраивается напротив тимина, а цитозин — напротив гуанина. Это правило носит название комплементарности. РНК организована сходным образом, с двумя главными отличиями. Во-первых, на месте тимина всегда находится другое азотистое основание: урацил (У). Во-вторых, хотя иногда в клетке встречаются небольшие двухцепочечные РНК из двух комплементарных цепей, чаще всего РНК существует в виде одной цепочки, одни участки которой связаны с белками, а другие комплементарны внутри одной молекулы, образуя сложные пространственные укладки [7]. Комплементарность лежит в основе копирования ДНК, в ходе которой цепи расплетаются, и к каждой цепи специальным арсеналом белков по матричному принципу [8] достраивается комплементарная. Так наследственный материал удваивается, чтобы потом разойтись по дочерним клеткам в ходе клеточного деления. РНК тоже может удваиваться. Это происходит или с маленькими РНК-цепочками у растений, дрожжей и червячка C. elegans [9], или с цепочками большего размера у вирусов, у которых наследственная информация находится в форме РНК, а не ДНК. Комплементарность также лежит в основе прямой и обратной транскрипции — перевода ДНК в РНК и обратно соответственно. При транскрипции двухцепочечный участок ДНК расплетается, и к цепи, которая кодирует ген, комплементарно достраивается участок РНК, который отделяется от ДНК и после завершения транскрипции живет своей жизнью в клетке. Хромосомы и хроматин У эукариот молекулы ДНК в клеточном ядре упакованы в хромосомы, в которых одна длинная молекула ДНК намотана на глобулы из белков-гистонов (как бусины на нитке) и сложена в компактную структуру вмeсте с другими молекулами белков и РНК. Всё вещество хромосом называют хроматином [3]. Еще в 1928 году Эмиль Хайтц заметил, что одни участки хроматина компактнее других, и разделил хромосомное вещество на развернутый эу- и компактный гетерохроматин [10]. Глобулы из гистонов носят название нуклеосом. Нуклеосомы устроены удивительно регулярно: каждая глобула имеет один и тот же план строения — восемь молекул гистонов (по две молекулы гистонов 2А (H2А), 2B (H2B), 3 (H3) и 4 (H4)) сложены в компактную структуру таким образом, что тетрамер (комплекс из четырех белков) из гистонов H3 и H4 оказывается «зажат» между двумя димерами (комплексами из двух белков) H2A и H2B. Вокруг одной глобулы обернуто 146 пар оснований молекулы ДНК (рис. 2) [11]. Такая упаковка позволяет уложить ДНК длиной в 2 метра в ядро размером в несколько микрометров, а также регулирует чтение генов. Кристаллическая структура нуклеосомы Рисунок 2. Кристаллическая структура нуклеосомы. 146 пар оснований ДНК обернуто вокруг октамера из гистонов. [11] Части гистонов выступают из нуклеосом и могут быть модифицированы — специальные белки-«писатели» пришивают к гистоновым «хвостам» разные химические группы: метильные, ацетильные, фосфатные, кротонильные, цитратные, серотонильные или же небольшие белки: убиквитин [12] и SUMO [13]. Другие белки — «читатели» — взаимодействуют с метками гистоновых «хвостов», причем в белках-«читателях» есть модули, специфично узнающие определенные метки. Еще есть специальные белки-«стиратели», снимающие метки с гистонов. После открытий первых гистоновых модификаций Дэвид Аллис и Брайен Штраль выдвинули гипотезу «гистонового кода»: комбинации гистоновых меток являются кодом, который читается другими белками и локально определяет молекулярные процессы, происходящие в местах комбинаций меток [14]. Однако похоже, что картина сложнее, и далеко не только гистоновые метки управляют молекулярными процессами на хроматине. Кроме того, хотя метки и бывают взаимоисключающими, они действуют по отдельности, а не в комбинациях [15]. Белки-читатели узнают отдельные метки, а для регуляции процессов на хроматине иногда может быть достаточно всего одной модификации. Интересно, что нуклеосомы могут отличаться друг от друга не только модификациями гистонов, но и самими гистонами. Есть так называемые варианты гистонов, которые могут заменять канонические гистоны в нуклеосомах. И структура нуклеосом с такими измененными гистонами слегка меняется. Как устроено окружение нуклеосом с намотанной на них ДНК? С ними взаимодействуют тысячи белков и молекул РНК. Почти всегда белки и РНК собираются и находятся в больших комплексах. Иногда в одиночку — вне комплексов — они не могут выполнять свою функцию. Такие белковые комплексы — экзосомы и протеасомы [16] — разбирают синтезированные РНК и белки на нуклеотиды и цепочки из нескольких аминокислот соответственно. Большие комплексы из белка и РНК — сплайсосомы и комплексы полиаденилирования — осуществляют процессинг матричных РНК: вырезают из нее некодирующие участки и строят полиА-хвост на 3′-конце. Короткие и длинные некодирующие РНК участвуют во многих процессах, происходящих в ядре, но в отличие от белков, редко обладают ферментативной активностью и, когда функционируют в комплексах, в основном играют структурную роль. Совсем короткие малые интерферирующие РНК (22 нуклеотидных остатка в длину) участвуют в образовании гетерохроматина и разрушении комплементарных РНК [7]. Хроматин на уровне нескольких нуклеосом Рисунок 3. Хроматин на уровне нескольких нуклеосом. Кроме упомянутых белков-»читателей», «писателей» и «стирателей», взаимодействующие белки можно разделить по таким функциям: Транскрипционные факторы связываются с определенными последовательностями ДНК и помогают другим белкам связаться рядом. Например, они помогают ферменту РНК-полимеразе сесть на ДНК и начать транскрипцию — перевод последовательности ДНК в РНК. Или помогать связаться с ДНК белкам, которые строят гетерохроматин [17]. Ремоделеры хроматина могут собирать, разбирать или двигать нуклеосомы взад-вперед по ДНК, а иногда накручивать ДНК на нуклеосомы и снимать с них двойную спираль, затрачивая при этом энергию АТФ. Хеликазы умеют расплетать двойную спираль ДНК и переплетать уже свернутые молекулы РНК. Топоизомеразы могут распутывать переплетенные или перезакрученные двойные спирали ДНК. иллюстрация Михаила Гурьева Линейные ДНК и РНК Совокупность молекул ДНК образуют генóм. Ген — это фрагмент линейной последовательности ДНК, который может переводиться в РНК. Перед каждым гéном есть промотор — область, с которой связывается осуществляющий транскрипцию фермент (ДНК-зависимая РНК-полимераза). В конце гена находится терминатор — область, где РНК-полимераза отсоединяется от цепи ДНК, чтобы транскрипция закончилась. Интересно, что на транскрипцию гена могут влиять последовательности ДНК, отстоящие от него иногда на миллионы нуклеотидов, но расположенные близко к промотору в пространстве (об этом мы будем говорить гораздо подробнее дальше). Эти элементы называются энхансерами, если они увеличивают транскрипцию гена, или сайленсерами, если уменьшают. Некоторые элементы ДНК на линейной последовательности — инсуляторы — находятся между энхансером/сайленсером и промотором, не дают сблизиться им в 3D, и, соответственно, не дают повлиять на транскрипцию гена. Также инсуляторы могут ограничивать распространение разных типов хроматина по линейной ДНК. У эукариот гены состоят из кодирующих и некодирующих участков, сменяющих друг друга на протяжении гена. Когда РНК с такого гена считывается, из нее вырезаются некодирующие участки (интроны), а кодирующие (экзоны) сшиваются. Такой процесс носит название сплайсинга. Иногда только некоторые кодирующие участки могут сшиваться, а другие деградируют (разбираются на строительные блоки). Это уже так называемый альтернативный сплайсинг. Линейный хроматин Как расположены белки и РНК на линейной последовательности ДНК? Во-первых, у каждого белка и по-своему модифицированного гистона свой неповторимый паттерн, или профиль связывания с ДНК (рис. 4). Даже когда профили связывания двух разных белков очень похожи, они немного отличаются друг от друга (рис. 5). Во-вторых, профили можно поделить на группы, а по этим группам профилей выделить типы хроматина. И получение профилей связывания, и выделение типов хроматина проводится с помощью компьютерных методов биоинформатики на основе данных ChIP-секвенирования и Dam-ID . Зачастую эти биоинформатические методы очень сложны и основаны на математической теории; мы разбираем их в заключительной главе этой статьи. Профиль белка на хроматине Рисунок 4. Профиль белка на хроматине, полученный после ChIP-seq или Dam-ID. По горизонтали отображена координата линейной ДНК, по вертикали — количество белка на данном участке ДНК. иллюстрация Михаила Гурьева Так, в одной из работ в клетках дрозофилы методом DamID определили профили связывания с ДНК 53-х белков, и на основе этого выделили пять типов хроматина, которые условно назвали «цветами» (рис. 5). Два цвета — красный и желтый — отнесли к разным типам активного хроматина, а еще три — синий, зеленый и черный — к разным типам неактивного. 53 профиля белков на хроматине после Dam-метилирования Рисунок 5. 53 профиля белков на хроматине после Dam-метилирования, объединенные в типы — «цвета» хроматина. Цвет, или тип хроматина, определяется в зависимости от того, какие белки преимущественно связываются с этими участками генома. [18] Чем отличаются активные цвета хроматина — красный и желтый? Когда ДНК удваивается, сначала удваиваются активные участки, а потом уже неактивные. Причем красные участки удваиваются раньше желтых. Кроме того, в желтом хроматине преимущественно расположены гены, которые активны всегда, а в красном — активные лишь при определенных условиях. Два из трех неактивных цветов хроматина были известны и до этой работы. Зеленый тип хроматина — так называемый классический гетерохроматин, в котором присутствует белок HP1a (heterochromatic protein 1a, гетерохроматиновый белок 1а) и белки, которые взаимодействуют с ним (см. далее). На «синем» хроматине располагаются белки группы Polycomb, которые регулируют гены, важные для развития организма. Черный хроматин в этой работе открыли впервые. Выяснилось, что это примерно половина генома, и в нем сравнительно мало генов и транскрипции; если в нем и есть гены, то в основном неактивные [18]. В другой работе, основанной на ChiP-seq 18-и гистоновых модификаций, хроматин плодовой мушки дрозофилы поделили на девять типов [19]. Интересно, что многие (а возможно, и все) из них — разновидности уже знакомых нам пяти «цветов» [20]. После дрозофилы хроматин классифицировали на типы и в других организмах [21]: в 15 типах клеток мыши и шести человеческих клеточных линиях хроматин разделили на семь типов [22], а кроме того, похожее деление провели и для червячка C. elegans [23] и нескольких растений [24]. ДНК в 3D Если взять ДНК из всех хромосом всего одной нашей клетки и вытянуть на полную длину, она составит целых два метра. Но диаметр клеточного ядра, в котором она уложена, — всего несколько микрометров. Следовательно, в ядре ДНК должна быть многократно свернута в пространстве. Фибрилла 30 нм существует только in vitro Рисунок 6. Фибрилла 30 нм существует только in vitro на основе модели фибриллы из [77] Долгое время на основе экспериментов в пробирке, в которых собирали хроматиновые структуры из очищенной ДНК и очищенных гистонов, считалось, что ДНК, намотанная на нуклеосомы, упакована в фибриллу диаметром 30 нм (рис. 6). Однако недавно эксперименты по 3D электронной микроскопии на клетках (их удалось сделать благодаря специальной окраске ДНК) показали, что такой фибриллы нет, зато есть изогнутые цепи диаметром от 5 до 24 нм [25], [26]. Также еще до развития специальных методов для изучения пространственной укладки ДНК проводились эксперименты, показывающие, что ДНК в ядре организована в огромные петли. Эти петли можно было заметить с помощью электронной микроскопии после обработки ядер очень высоко концентрированной солью. Они были прикреплены к белковой основе ядра, оставшейся после того, как из ядра под действием соли уплыло много белков хроматина [27], [28]. Много новых открытий пришло с развитием методов Hi-C [3], [29] и Micro-C [30], о которых мы расскажем в последней главе этой статьи. Во-первых, выяснилось, что участки ДНК сворачиваются в небольшие глобулы (что-то наподобие шариков из скомканных нитей), которые, в свою очередь, сворачиваются в глобулы всё большего и большего размера (рис. 7) [29]. Глобулы из последовательностей ДНК размером от 100 тысяч до 1,5 миллионов нуклеотидных остатков получили название топологически ассоциированных доменов (ТАДов) [31]. Во-вторых, многие участки ДНК выпетливаются. Как соотносятся петли и глобулы? Похоже, что основания части петель совпадают с основанием глобул [32]! То есть сначала формируются петли, которые иногда «комкаются» в глобулы. Внутри больших петель могут быть петли поменьше. Правда, у плодовой мушки дрозофилы наличие петли зафиксировать на границе ТАДов пока не удалось, только внутри [33]. Пространственная упаковка ДНК Рисунок 7. Пространственная упаковка ДНК. Левая панель: укладка хроматина во фрактальные глобулы. Хромосомные территории состоят из глобул поменьше, которые, в свою очередь, состоят из глобул еще поменьше. Правая панель: фрактальная глобула в объеме и в разрезе. [29] Интересно, что есть как глобулы с активными генами, так и глобулы, в которых гены замалчиваются. И всё вещество хромосом, весь хроматин, можно разделить на два компартмента — А и B, которые отличаются друг от друга тем, как часто контактируют в них участки ДНК. В B побольше, в A поменьше. Цитологи уже давно подметили, что когда клетка делится, ee хромосомы гораздо компактнее. У многих организмов, в том числе у человека, есть половые и неполовые (соматические) хромосомы. Из всего набора хромосом к каждой неполовой хромосоме можно подобрать очень похожую на нее. Две половые хромосомы могут быть как похожими (например, две Х хромосомы у женщины), так и разными (Х и Y хромосомы у мужчины). Так, по набору половых хромосом у многих организмов, включая человека, в большинстве случаев можно определить пол. (Однако в целом пол — понятие куда более комплексное, чем присутствие определенного набора хромосом [34], [35].) Две одинаковые по набору и порядку генов хромосомы, соединенные перетяжкой, образуют нечто похожее на букву X, которой часто обозначают хромосомы в школьных учебниках. Как свернуты хромосомы в такие буквы Х? По тем же принципам петель, как и хромосомы в неделящихся в данный момент клетках, только немного по-другому. В случае хромосом клеток, которые делятся в данный момент, часть ДНК закреплена на линейном каркасе из белков, из которого исходят петли ДНК. И это не те же самые петли, что и в неделящихся на данный момент клетках, а другие [36], [37]. Когезины и конденсины Что меняет форму хромосом, когда клетка собирается делиться? Этим занимаются белки конденсины. Интересно, что они устроены очень похоже на белки, которые поддерживают петли в ДНК — когезины. Все эти белки собраны в конструкции, подобные кольцу, маленькая часть которого открывается. Именно в это отверстие и продевается ДНК, после чего оно закрывается. В случае когезинов, две двухцепочечные цепи ДНК оказываются зажаты в основании петли и не могут разойтись (как всё это выглядит, см. на видео 1). В случае конденсинов процесс изучен хуже, но, похоже, происходит примерно то же самое, только, в отличие от когезинов, они держат другие петли — не те, что присутствуют в хромосомах, когда клетка не делится (см. раздел о том, как ДНК уложена в ядре). Интересно, что комплексы могут не только держать петли, но и делать их. Этот процесс пока плохо изучен, но похоже, что белки перемещаются по ДНК, выпетливая ее, пока не встречают особые белки, связанные с блокирующими последовательностями ДНК — инсуляторами, — где и застревают [38–42]. Видео 1. Выпетливание хроматина анимация лаборатории Леонида Мирного Хроматин в 3D В одном из предыдущих разделов мы обсудили, что можно выделить разные типы («цвета») активного и неактивного хроматина в зависимости от того, какие белки он связывает. Возникает логичный вопрос: если ДНК свернута в пространстве, как организованы в 3D разные участки линейного хроматина? Если у хроматина можно выделить «цвета», то как покрашено клеточное ядро? Основной принцип укладки хроматина можно сформулировать так: подобное часто, но не всегда, взаимодействует с подобным. Например, активные и неактивные участки хроматина взаимодействуют с участками такой же активности в пространстве [43]. Также давно известно, что если покрасить клетку на некоторые белки, которые сидят преимущественно в одном из цветов хроматина (например, тот же HP1a), то такие белки образуют отдельные структуры в ядре. HP1a-гетерохроматин, например, образует от одного до трех доменов в зависимости от того, собирается клетка делиться или нет [44]. Еще было показано, что многие домены от 10 до 500 тысяч нуклеотидных остатков длиной образуют кластеры. Их можно увидеть в клетках под микроскопом, если последовательности ДНК этих доменов в клетках спарить со светящейся комплементарной ДНК [45]. В общем-то, тот факт, что ДНК свернута в пространстве выпетливанием в отдельные домены (например, ТАДы), уже подразумевает, что участки хроматина, недалекие друг от друга на линейной последовательности ДНК, с приличной вероятностью будут располагаться недалеко друг от друга в пространстве. И действительно, линейные хроматиновые домены коррелируют, то есть похожи на пространственные домены ДНК [46]. Уже известны целые ТАДы, целиком покрашенные в отдельный цвет хроматина (например, синие Polycomb-ТАДы у дрозофилы [47]). Как связаны между собой функции разных белков? Каждый белок в клетке взаимодействует с другими белками или иными молекулами, и следовательно, у него есть какая-то функция. А взаимодействует с Б, структура Б меняется, взаимодействие Б с другими молекулами меняется, запускается каскад. Конечно, речь идет только о значимом взаимодействии А с Б, меняющим Б, а не о любом. Часто таких функций несколько, причем на первый взгляд они могут быть не связаны. Например, как в ядре, так и в цитоплазме есть протеасома, одна из субъединиц которой участвует в ремоделинге хроматина [48]. Как одна функция может влиять на другую? Давайте разберем несколько примеров. Например, и у человека, и у мушек Drosophila есть белок MOF (males absent on the first, самцы отсутствуют в первом <поколении>), и самцы мух с мутантным MOF не развиваются. Этот белок навешивает ацетильные метки на гистоны и вовлечен в систему дозовой компенсации у мушек. У самок дрозофилы две Х-хромосомы, а у самцов одна. И чтобы гены с этой хромосомы читались у обоих полов в одинаковом объеме, их транскрипция у самцов удвоена. Один белок — MSL2 (male specific lethal 2, только самцы летальны 2) — синтезируется только у самцов. Он собирает на Х-хромосоме самцов комплекс из белков, в который входит и MOF, окрашивая Х-хроматин в особенный «цвет» (о чем речь шла выше). MOF навешивает на гистоны ацетильные метки, заряженные отрицательно и потому отталкивающиеся друг от друга, что делает хроматин более доступным для белков, осуществляющих транскрипцию. Таким образом, гены, на которых MOF ацетилирует гистоны , читаются лучше [49] (а это и есть дозовая компенсация). Недавно выяснилось, что MOF находится не только в ядре, но и в митохондриях, где регулирует транскрипцию генов, отвечающих за дыхание [50]. Теперь один пример про неактивный хроматин. Тройное метилирование по девятому лизину гистона (H3K9me3) — самая известная модификация такого хроматина. Чтобы навесить метильные метки на этот лизин, может потребоваться его деацетилировать. С H3K9me3 связывается один из главных белков гетерохроматина — HP1a (heterochromatin protein 1 alpha, гетерохроматиновый белок 1 альфа). Молекулы HP1a на соседних нуклеосомах прочно взаимодействуют между собой, и таким образом сближают нуклеосомы. Таким образом, определенные модификации гистонов (снятие ацетильных и навешивание метильных меток на H3K9) компактизируют хроматин, снижая его активность [51], [52]. Известно, что возле точки начала транскрипции гена на ДНК нуклеосомы расположены определенным образом. В дрожжах было показано, что, если выключить в клетке транскрипцию, то позиции нуклеосом меняются [53]. Как мы помним, именно ремоделеры хроматина двигают нуклеосомы взад-вперед по ДНК. Следовательно, транскрипция влияет на ремоделинг хроматина. Может ли быть обратное? Да, может. Например, немного подвинув нуклеосому, ремоделер хроматина может высвободить специальную последовательность ДНК — сайт связывания транскрипционного фактора (белка, помогающего РНК-полимеразе сесть и начать транскрипцию гена), — который с ней свяжется и запустит транскрипцию [54]. Модельный эксперимент эпигенетики Сегодня, открыв PubMed, можно получить представление о типичной работе по молекулярной биологии. Там, например, может описываться новая функция какого-то белка. Чтобы установить его функции, обычно делают иммунопреципитацию и масс-спектрометрию (см. методы) и определяют, какие белки взаимодействуют с изучаемым. Чтобы проверить предполагаемую функцию, белок убирают из клетки (или значительно снижают его уровень) и смотрят на фенотип: что изменилось без него? Представьте: мы изучаем белок А, выявляем список белков, с которыми он взаимодействует, и получаем, что они связаны с транскрипцией. Мы формулируем гипотезу, что наш белок A повышает или понижает уровень транскрипции. Для ее проверки нужно понизить в клетках уровень A и определить количество РНК отдельных генов в этих клетках, а также сравнить его с обычными (контрольными) клетками. Так мы выясним, на транскрипцию каких генов влияет А (и влияет ли). Можно дальше сделать ChIP-секвенирование и определить, на каких последовательностях в геноме «сидит» А (то есть — построить профиль белка А; см. рис. 4 и 5). Может выясниться, что это происходит на промоторах тех генов, которые он регулирует. Дальше можно поинтересоваться, что общего у «его» промоторов? Например, располагаются ли они в определенных хроматиновых доменах, на определенных хромосомах, на тех же местах, где «сидят» другие белки с известной функцией? Допустим, мы нашли, что промоторы с А располагаются в активном хроматине, а сам он повышает транскрипцию «своих» генов. Но как белку A это удается? Посмотрим внимательнее на список белков, с которыми взаимодействует А. Допустим, мы нашли среди них Б, который навешивает на хвосты гистонов ацетильные метки (которые, как мы помним, расталкиваясь, «разрыхляют» хроматин и делают его доступнее для белков транскрипции). Можно выдвинуть гипотезу, что наш белок не просто связывается с ДНК на промоторах в активном хроматине, а привлекает туда белок Б, ацетилирующий гистоны и повышающий транскрипцию. Можно понизить уровень А в клетке и сделать ChIP-секвенирование белка Б и навешиваемой им ацетильной метки гистонов. Так можно установить, что количество Б на хроматине тоже понижается, и гистоны под влиянием А теряют ацетильные метки. И так далее. Можно задавать всё новые и новые вопросы и отвечать на них, хотя, конечно не всегда эксперименты сработают и дадут однозначный ответ. Почему данные могут быть ложными или противоречить друг другу? Иногда потому, что мы неправильно их интерпретируем. Например, если вернуться к списку белков — потенциальных партнеров белка А, — то может оказаться, что идентификация Б была неспецифической: например, из-за высокой концентрации в ядре (а это вполне возможно для белков, связанных с транскрипцией, или ремоделеров хроматина). Иногда данные, полученные в пробирке, ничего не говорят о процессах в культуре клеток, а они, в свою очередь, кардинально отличаются от того, что происходит в живом организме. Потому что живые клетки — гораздо более сложные системы, чем те, что собраны из молекул в пробирке, а культуры клеток, которые культивируют в лабораториях уже долгие-долгие годы, эволюционировали, изменились и уже не совсем похожи на организмы, из которых их взяли. Как бы то ни было, полученные данные, пусть и противоречивые, всегда учат нас чему-то новому, и их важно публиковать, пусть и не в самых трендовых журналах. К сожалению, не все ученые это делают. Какие научные работы делают ученые? Или все статьи важны Пожалуй, все работы можно разделить на два типа. Первые практически не меняют сложившуюся парадигму, лишь добавляя детали в уже существующую картину. Например, работы, которые открывают новые молекулы, взаимодействующие с интересующей нас молекулой А, без связи функции А с совершенно другими функциями взаимодействующих молекул. Или работы, описывающие, как молекула А взаимодействует с молекулой Б, без описания принципиально новых связей между функциями А и Б (или значимо новых элементов строения или взаимодействия А и Б, если это работа по структурной биологии). Такие работы могут быть очень важны, например, для подтверждения результатов больших исследований, где изучаются взаимодействия между собой тысяч молекул. В случае таких масштабных работ очень велик риск ошибок, и каждое новое открытое взаимодействие рассматривается как потенциальное и требующее подтверждения. И статьи, которые детально подтверждают отдельные взаимодействия, очень важны. Второй тип работ — те, которые вводят новые научные концепции. Они значительно меняют схему происходящего, которую мы можем представить себе исходя только из предшествующих данных. Например, работы, объясняющие связь разных функций молекул, скажем, транскрипции и ремоделинга хроматина. Или работы, описывающие принципиально новые методы, структуру укладки ДНК в ядре, классифицирующие разные типы («цвета») хроматина. И хотя работы второго типа кажутся более привлекательными, и именно их старается делать большая часть ученых, не стоит недооценивать работы, которые на первый взгляд не отвечают на какой-либо очень важный вопрос. Нельзя угадать, возможно, через много лет выяснится, что какая-то из давно открытых молекул очень важна и ее нужно изучать. И тут-то и пригодятся данные про эту молекулу, открытые давным-давно и плохо цитируемые. В следующей статье цикла мы рассмотрим, что представляют собой хроматиновые домены и какими они бывают. Но в заключение этого материала идет еще одна — последняя — глава, рассказывающая о методах, которыми исследуют строение ядра клетки и упаковку ДНК в нем. Методы изучения ДНК и хроматина Как получить много ДНК и как определить ее последовательность? Теперь давайте разберем несколько методов, которые ученые используют в своих исследованиях. Увеличение количества (амплификация) интересующего фрагмента ДНК — ключевая химическая реакция в молекулярной биологии. Она называется полимеразной цепной реакцией (ПЦР) [55], [56]. Например, чтобы клонировать ген (вставить его в плазмиду — кольцевую последовательность ДНК, которая может размножаться в бактериях), нужно получить огромное количество копий гена и плазмиды. Много плазмиды можно размножить в бактериях. А что делать с геном? В отличие от плазмиды, линейная последовательность в бактериях удваиваться не будет. Химически синтезировать длинную цепочку ДНК очень дорого. Зато множество копий целевого гена можно «наработать» при помощи ПЦР. Также, например, во многих методах для определения последовательности ДНК — секвенирования — нужно большое количество молекул ДНК, и их, опять-таки, можно «наработать» ПЦР. «Диаэм» Новинки ДНК-амплификаторов: решения от компании «Диаэм» «Диаэм» предлагает ознакомиться с тремя решениями для проведения ПЦР: ProFlex Термоциклеры семейства ProFlex — скоростные и точные амплификаторы с современным дизайном, подойдут для любой лаборатории, использующей в своей работе ПЦР. Данное семейство включает в себя пять моделей с единой базой и сменными термоблоками под различные задачи. Доступен как стандартный реакционный блок на 96 лунок, так и двойные блоки на 96 и 384 образца, а также уникальные термоблоки: для цифровой ПЦР и OpenArray-карт и тройной термоблок, позволяющий ставить три полностью независимых ПЦР. VeritiPro В 2020 году на смену зарекомендовавшим себя моделям Veriti выпущен еще более быстрый амплификатор VeritiPro со скоростью изменения температуры до 6,0 °С/сек и функцией эмуляции температурных характеристик термоциклеров прочих производителей (Applied Biosystems 2720, Applied Biosystems Veriti, Bio-Rad T100, Bio-Rad MyCycler, Takara Dice PCR Thermal Cycler, BIOER XP Cycler, Eppendorf Mastercycler, MJ Research PTC-200). Termix Тем, кому нужен амплификатор, занимающий немного места, имеет смысл обратить внимание на суперкомпактный амплификатор Termix отечественного производства, который имеет габариты 16×10×11 см и вес всего 1 кг! Этот экономичный персональный амплификатор, вмещает 16 пробирок объемом 0,2 мл и может использоваться как в исследовательских, так и в учебных целях. Материал предоставлен партнером — компанией «Диаэм» «СкайДжин» Решения для амплификации нуклеиновых кислот от компании SkyGen: ПЦР и LAMP Метод ПЦР — самый популярный способ получения большого количества копий интересующего фрагмента ДНК, причем разновидностей ПЦР существует много [55]. Для большинства из них американская компания New England Biolabs разработала решения, существенно упрощающие работу исследователя. Образец выделенной ДНК, содержащий фрагмент, который необходимо амплифицировать. Полимераза — основной компонент ПЦР. Для стандартного эксперимента достаточно использовать Taq ДНК-полимеразу (или One Taq с 3′–5′ экзонуклеазной активностью); для высокоточной ПЦР — Q5 ДНК-полимеразу, которая точнее Taq-полимеразы в 280 раз; если необходимо амплифицировать длинные фрагменты (до 30 тысяч п.о.), то прекрасно подойдет LongAmp ДНК-полимераза. Существуют решения даже для таких специфических задач, как ПЦР в образцах крови без этапа выделения ДНК (Hemo KlenTaq ДНК-полимераза) или амплификация фрагментов, содержащих урацил (Q5U ДНК-полимераза). Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) являются строительными блоками, необходимыми для синтеза новых фрагментов ДНК. Условия реакции индивидуальны и очень важны для оптимальной работы полимеразы, поэтому полимеразы NEB поставляются уже с подходящим буфером или несколькими буферами на выбор в зависимости от особенностей ДНК-матрицы пользователя. Праймеры — пары одноцепочечных олигонуклеотидов, специфичных к целевой области исследования. Компания SkyGen предоставляет услуги по синтезу праймеров.Развернуть Полезные онлайн-инструменты для планирования эксперимента Подбор реагентов для ПЦР в зависимости от конкретных задач Вычисление температуры отжига праймеров Оценка доли точных ампликонов База данных полимераз Существует и альтернативный способ увеличения количества желаемого участка нуклеиновой кислоты — петлевая изотермическая амплификация ДНК и РНК (LAMP/RT-LAMP). По сравнению с ПЦР технология LAMP обладает рядом преимуществ: она более специфична, поскольку использует не два, а 4–6 праймеров, занимает меньше времени и не требует дорогого оборудования. В портфолио NEB есть как отдельные компоненты для проведения LAMP, так и готовые решения. Например, готовая смесь для колориметрической петлевой изотермической WarmStart-амплификации ДНК и РНК, в которую потребуется добавить только ДНК-матрицу и праймеры, а для проведения самой реакции понадобится только термоблок. Компания SkyGen является эксклюзивным дистрибьютором продукции New England Biolabs в России и СНГ. Материал предоставлен партнером — компанией «СкайДжин» Для РНК реакции амплификации не разработано, несмотря на то, что в клетках существует процесс удвоения РНК. Проблема в том, что РНК-зависимая РНК-полимераза, осуществляющая процесс, не сможет работать при высоких температурах, а при низких комплементарные цепи РНК будут не расходиться, а слипаться. Но молекулярным биологам это и не нужно. Много РНК можно наработать транскрипцией с ДНК, а ДНК уже наработать при помощи ПЦР. Как определить последовательность ДНК? Технологии секвенирования появились в середине прошлого века, сейчас их уже много, и они всё еще совершенствуются. Рассмотрим один из самых используемых методов: секвенирование на платформе «Иллюмина» [56], [57]. Двухцепочечная ДНК, которую нужно секвенировать, расщепляется на фрагменты, после чего к их концам ДНК-лигазами пришиваются короткие двухцепочечные последовательности — адаптеры. После этого количество фрагментов увеличивают с помощью ПЦР. Раствор с такими фрагментами наносится на платформу, к которой пришиты праймеры, комплементарные адаптерам. На платформе фрагменты ДНК копируются таким образом, что скопировавшиеся фрагменты оказываются пришитыми к платформе. «Диаэм» Фрагментация ДНК и хроматина: уникальное решение от «Диаэм» Качественная фрагментация ДНК или хроматина (shearing) при подготовке библиотек к NGS — важнейшее условие для получения качественных данных. Один из наиболее простых способов — нарезка ДНК при помощи специальных ферментов — эндонуклеаз рестрикции. Преимущества метода — простота и невысокая стоимость. Однако после каждой ферментативной реакции необходимо проводить очистку от фермента и иных компонентов реакции (спиртовым осаждением ДНК или сорбентными методами), что всегда сопряжено с потерями исследуемого материала. Сейчас всё больше распространяются методы физического расщепления ДНК и хроматина. Преимущества физических методов перед ферментативными — хорошая воспроизводимость результатов (стабильный диапазон длин получаемых фрагментов) даже для разного по качеству стартового материала и низкая зависимость от последовательности. Один из наиболее качественных физических способов — ультразвуковая фрагментация (соникация). Для этого исследователю понадобится специальный прибор — соникатор, среди которых выделяется прибор с действительно уникальными способностями соникатор Q800R3 от Qsonica, специально сконструированный для нарезки ДНК и хроматина. Q800R3 быстро (за 20–30 минут) расщепляет геномную ДНК и хроматин на фрагменты заданной длины от 150 до 3000 п.н. с высокой точностью. Длина получаемых фрагментов регулируется в зависимости от задач пользователя и задается путем уменьшения или увеличения времени и интенсивности воздействия на ДНК ультразвуком. Разработаны протоколы под различные типы тканей, которые можно найти на сайтах компаний Qsonica и «Диаэм». Qsonica Q800R3, в отличие от прочих ультразвуковых фрагментаторов, работает с обычными полипропиленовыми пробирками типа Eppendorf объемом 1,5 мл или пробирками для ПЦР на 0,5 и 0,2 мл, в которых и происходит фрагментация образцов, тогда как другие распространенные модели требуют наличия специальных, не всегда дешевых пробирок. К тому же в Q800R3 возможна одновременная фрагментация до 18 образцов, что явно помогает сэкономить время и трудозатраты. Видео 2. Система ультразвуковой фрагментации ДНК Q800R3 Материал предоставлен партнером — компанией «Диаэм» После этого можно провести секвенирование. Тут тоже не обходится без ПЦР, только с особенностями. К нуклеотидам (как мы помним, это строительные блоки для ДНК) присоединены цветные метки. После пришивания такого меченого нуклеотида к цепочке ДНК-полимераза не способна сама пришить следующий. Это обеспечивает паузу, за время которой можно определить (по цвету флуоресценции), что это за нуклеотид. Определение проводится специальной камерой над платформой, к которой пришиты фрагменты ДНК, служащие матрицей для ПЦР. После этого флуоресцентную метку от нуклеотида отщепляют, делая возможным присоединение следующего нуклеотида; определяют его «цвет»; и так далее, пока ПЦР не закончится. Так можно узнать последовательности коротких фрагментов — ридов (от англ. read — читать), или прочтений. Их длина в технологии «Иллюмина» не превышает 600 нуклеотидных остатков, а чаще — ≈200–300. Поскольку при фрагментации ДНК (которая происходит в самом начале процедуры) разные молекулы разрываются в разных местах, риды будут перекрываться, и, «выровняв» их на компьютере, можно собрать длинные исходные последовательности ДНК. К сожалению, такая сборка может давать сбои в участках ДНК, состоящих из повторяющихся последовательностей. Для секвенирования РНК чаще всего начинают с обратной транскрипции — синтеза ДНК с цепи РНК. Фермент, который осуществляет это, называется РНК-зависимой ДНК-полимеразой. И полученную ДНК потом секвенируют. Совсем недавно появившийся метод секвенирования ДНК и РНК — нанопоровое секвенирование [58], [59]. Его принцип крайне прост по сравнению с секвенированием на платформе «Иллюмина». Представьте себе небольшую камеру, заполненную раствором электролита и разделенную липидной мембраной, содержащей белковую пору. Под напряжением через пору пойдет электрический ток (поток ионов), а если в камере окажется молекула ДНК или РНК, она, подобно червячку, тоже начнет протискиваться через пору, и с прохождением каждого нуклеотидного остатка ток будет меняться, причем — в соответствии с тем, какой именно остаток проходит через пору в данный момент. Длина ридов в нанопоровом секвенировании — много тысяч пар оснований нуклеотидных остатков! Это очень много по сравнению с «Иллюминой». К тому же, такое секвенирование становится всё дешевле, а приборы — всё меньше в размерах. Можно секвенировать ДНК или РНК, просто загрузив ее в прибор немногим больше флешки. Правда, к сожалению, при нанопоровом секвенировании велика вероятность ошибок, что ограничивает его применение. «СкайДжин» Детекция метилированных оснований: решения для нанопорового секвенирования от компании Oxford Nanopore Technologies Oxford Nanopore Technologies Метилирование играет фундаментальную роль в регуляции экспрессии генов, а определенные паттерны метилирования ассоциированы с различными болезнями, такими как нарушения развития и онкологические заболевания. Поскольку нанопоровое секвенирование не требует этапа ПЦР при подготовке библиотек, ДНК с модифицированными основаниями можно секвенировать напрямую, что позволяет детектировать эти модификации. (Почитайте о методе: «Нанопоровое секвенирование: на пороге третьей геномной революции» [59].) Компания SkyGen является эксклюзивным дистрибьютором продукции Oxford Nanopore Technologies в России и СНГ. Материал предоставлен партнером — компанией «СкайДжин» Методы секвенирования рутинно применяются для определения последовательностей геномов и уровня РНК в клетках, а также являются заключительным этапом таких методов как ChiP-seq, Dnase-seq, ATAC-seq и других. Определение профилей белков на хроматине Для выявления местоположения белков на ДНК — то есть определения ДНК-профилей (см. рис. 4 и 5) — был разработан метод иммунопреципитации хроматина и секвенирования (ChIP-sequencing, chromatin immunoprecipitation sequencing; рис. 8) [60], [61]. Схема ChiP-секвенирования Рисунок 8. Схема ChiP-секвенирования. Клетки фиксируют формальдегидом, сшивающим многие молекулы между собой. В том числе молекулы белков пришиваются к ДНК, если связаны с ней. Потом хроматин дробят на фрагменты (200–300 нуклеотидов) ультразвуком или ферментами эндонуклеазами (действуют на ДНК как молекулярные ножницы [62]). Важно, что при нарезке ДНК молекулы всё еще сшиты между собой. Потом добавляют антитело — белок, который специфично взаимодействует только с нужным нам белком и ни с какими другими. Белки связываются с антителами, а их в свою очередь можно выловить из раствора специальными шариками, «уцепившись» за константные части молекул антител. Итак, теперь у нас есть комплексы сшитых белков, за которые держатся антитела, за которые в свою очередь держатся шарики, которые можно отделить от раствора. Такие шарики с антителами и молекулярными комплексами отмывают специальными растворами от неспецифически налипших молекул, а потом шарики с антителами и молекулярными комплексами отделяют от раствора в отдельную пробирку. Туда добавляют раствор с ферментами, которые разрушают белки и РНК, и нагревают ее до 65 °C. При этом белки и РНК разрушаются, а формальдегидные сшивки между молекулами от нагрева исчезают. Теперь можно очистить фрагменты ДНК, с которыми взаимодействовал исследуемый белок, и секвенировать их. Результаты секвенирования покажут, с какими именно участками исходной ДНК взаимодействовал исследуемый белок. иллюстрация Михаила Гурьева по [61] Антитела — белки в форме буквы Y, которые вырабатывает наша иммунная система. Aнтитело можно сделать, введя животному в кровь белок, с которым потенциальное антитело должно взаимодействовать. Потом специальные иммунные клетки вырабатывают антитела в крови животного в ответ на инородный белок. Можно изолировать эти иммунные клетки и сделать так, чтобы они производили антитела в условиях лаборатории. Далее антитела легко почистить и использовать в методах молекулярной биологии. Подробнее о применении антител в исследованиях и медицине можно прочесть в спецпроекте «Биомолекулы» «Терапевтические антитела», например в статье «Краткая история открытия и применения антител» [63]. «СкайДжин» Реагенты для ChIP-seq на платформе Illumina в портфолио SkyGen Целью эксперимента ChIP-seq является получение последовательностей областей генома, связанных с интересующим исследователя белком. Чтобы каждая стадия процесса была максимально эффективной, необходимо подбирать хорошие реагенты, ведь от качества и количества полученных ДНК-библиотек зависит результат секвенирования. Линейка NEBNext от компании New England Biolabs для подготовки образцов к секвенированию на платформе Illumina позволяет получать высокий выход библиотек, даже при низком входном количестве образца. Одним из ключевых преимуществ NEBNext является модульность наборов: весь протокол разбит на этапы, и у пользователя есть возможность работать как с готовым набором, так и с отдельными модулями, которые могут также использоваться и для других видов секвенирования. NEBNext Иммунопреципитация Интересующие белки сшивают с ДНК при помощи формальдегида и фрагментируют ультразвуком. Затем эти белки связываются с антителами, которые имеют сродство к магнитным шарикам. Поместив пробирку со смесью образца, антител и шариков в магнитный штатив, можно отделить интересующий белок со связанной ДНК от остальных компонентов раствора. Восстановление и аденилирование концов фрагментов ДНК Модуль 1: Фрагменты ДНК освобождают от белков, липкие концы восстанавливают и навешивают дезоксиаденозинтрифосфат на 3′-конец цепи. Лигирование адаптеров Модуль 2: Адаптеры, необходимые для протокола секвенирования, лигируются к аденилированным концам ДНК-фрагментов, образуя гантелеобразные структуры, содержащие урацил посередине петли. Далее белок USER разрезает петлю по урацилу, что позволяет получить фрагменты с адаптерами, готовые к дальнейшей ПЦР. ПЦР Модуль 3: Этап ПЦР позволяет получить достаточное количество ДНК-библиотек для секвенирования, а также предоставляет возможность мультиплексирования. На стадии ПЦР при подготовке библиотек к секвенированию очень важно использовать высокоточную полимеразу, поэтому здесь применяют Q5 ДНК-полимеразу. Модульная система линейки NEBNext позволяет сократить расходы на реагенты благодаря взаимозаменяемости модулей. Для ChIP-seq можно использовать готовый набор, или собрать модули для каждого этапа (восстановления концов, лигирования и ПЦР). Если в дальнейшем исследователь захочет секвенировать геномную ДНК, ему потребуется добавить к существующим модулям только реагенты для фрагментации ДНК. Компания SkyGen является эксклюзивным дистрибьютором продукции New England Biolabs в России и СНГ. Материал предоставлен партнером — компанией «СкайДжин» Похожий подход используется и для определения профилей определенных молекул РНК на ДНК [64]. Только для того, чтобы вытащить сшитые молекулярные комплексы из раствора, там используют не антитела, а молекулы РНК, комплементарные изучаемой. Эти РНК, в свою очередь, пришиты к биотину. Модифицированные биотином молекулы РНК можно соединить с шариками, «увешанными» молекулами белка стрептавидина: это прекрасная «удочка» для биотина, ведь взаимодействие этих двух молекул — одно из самых сильных в молекулярной биологии. Называется такой метод «аффинная очистка РНК» (RNA affinity purification, RAP) [65], [66]. Наконец, последний метод, который мы рассмотрим в этом разделе, является альтернативой ChiP-seq’у, но выгодно отличается тем, что для него нам не требуется специфическое антитело под нужный нам белок. Метод называется «идентификация ДНК-аденин-метилирования» (DNA adenine methyltransferase identification, DamID) по имени фермента метилтрансферазы Dam, которая метилирует ДНК по аденинам строго в последовательностях ГАТЦ (рис. 9) [67]. Такой метилирующий ДНК фермент в природе встречается только в бактериях, а в эукариотах ни фермента, ни метилированного аденозина нет. Поэтому можно отличить метилирование, протекающее в клетке в естественных условиях (по цитозинам), от метилирования, которое сделал этот фермент. Ген фермента Dam пришивают к гену нужного нам белка, и этот гибрид доставляют в клетку, где с него считывается гибридная мРНК, в результате чего транслируется гибридный белок. Он метилирует ГАТЦ-последовательности преимущественно в тех местах, где сидит его натуральный аналог. Но ведь и вторая часть гибридного белка — фермент Dam — тоже будет взаимодействовать с какими-то белками хроматина, и следовательно, будет притаскивать гибридный белок на участки ДНК, где натурального белка нет. Поэтому в качестве контроля берут клетки, куда доставляют только ген белка Dam. Белок, получающийся с РНК такого гена, будет метилировать только места ДНК, куда идет он сам. И сравнивая сайты метилирования гибридного белка и одиночного белка Dam, мы сможем отличить сайты связывания гибридного белка, которые специфичны для исследуемого белка, от сайтов, которые специфичны для Dam. Схема Dam-метилирования Рисунок 9. Схема Dam-метилирования. Как обнаружить сайты метилирования на очищенной ДНК? Для этого ДНК сначала нарезают рестриктазой DpnI, которая режет только метилированные по аденину ГАТЦ-последовательности. Затем к такой нарезанной ДНК пришивают адаптеры — короткие двухцепочечные последовательности ДНК. После чего нарезанную ДНК с пришитыми адаптерами нарезают второй раз рестриктазой DpnII, которая режет только неметилированные ГАТЦ-последовательности. При этом с двумя адаптерами по обе стороны фрагмента остаются только те кусочки ДНК, которые лежат между двумя соседними метилированными ГАТЦ-последовательностями. И такие фрагменты нарабатывают ПЦР, подбирая праймеры к последовательностям адаптеров. иллюстрация Михаила Гурьева С помощью методов ChIP-секвенирования и Dam-ID ученые получили множество профилей разных белков на ДНК. В том числе, эти данные классифицировали на типы, или «цвета», хроматина (см. раздел «Линейный хроматин»). Определение доступности хроматина Традиционно доступность хроматина определяли, подвергая ядра действию ДНКазы, которая режет только открытые участки хроматина и не пробирается к закрытым. На основе этого фермента разработали высокопроизводительный метод детекции ДНКазо-чувствительности хроматина — DNAse-seq. Сначала ядра обрабатываются ДНКазой. Затем к концам участков, которые она порезала, лигируют биотинилированный адаптер. Потом ядра обрабатывают рестриктазой, и образуются фрагменты с рестриктным сайтом на одном конце и адаптером на другом. К ним пришивают второй адаптер. Затем такие фрагменты с двумя адаптерами отделяют на стрептавидиновые шарики и секвенируют на платформе «Иллюмина» [68]. Позже появился более продвинутый метод ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing — метод для определения хроматина, доступного транспозазе, используя секвенирование). В нем ядра инкубируют с ферментом транспозазой. Она вносит двухцепочечные разрывы в ДНК в открытых участках хроматина и пришивает адаптеры в местах разрывов. Затем такие вырезанные участки с адаптерами секвенируют [69]. Определение контактов ДНК в пространстве Как отследить взаимодействующие участки ДНК в ядре? Для ответа на этот вопрос было разработано несколько методов, в основе которых лежит один и тот же принцип (рис. 10) [3], [70], [71]. Схема С-методов Рисунок 10. Схема С-методов. Представим себе два двухцепочечных участка ДНК, соединенные каким-нибудь белком. Сначала клетки фиксируют формальдегидом. При этом все молекулы в клетках химически сшиваются. В том числе фрагменты ДНК сшиваются с белками, которые их соединяют. Затем добавляют фермент рестриктазу, он действует как молекулярные ножницы и разрезает ДНК по определенным последовательностям. При этом разрезы вносятся в том числе и в фрагменты ДНК, соединенные с белком. После этого сшитые молекулы с порезанной ДНК разводят в большом объеме и сшивают ДНК заново ферментом лигазой. При этом пара фрагментов ДНК, находящихся близко друг к другу, сшиваются. Потом формальдегидные, но не ДНК-сшивки, химически удаляют, и белки, которые связывали близкие друг к другу участки ДНК, отделяются от уже гибридных участков ДНК. Теперь у нас имеется набор линейных и кольцевых молекул ДНК (в зависимости от того, сшилась одна или обе части фрагментов), включающие в себя фрагменты ДНК, которые находились рядом. В 3С, подобрав правильные праймеры, методом ПЦР проверяют, находятся ли два известных участка ДНК (например, промотор и энхансер) близко друг к другу [72]. Во втором методе из серии — 4С — гибридные молекулы ДНК, полученные по схеме 3С, разрезают рестриктазами и сшивают лигазами еще раз, при этом образовавшиеся после рестриктаз короткие фрагменты ДНК лигируются сами на себя, образуя кольцевые молекулы. Дальше ставят так называемую обратную ПЦР — праймеры подбирают к концам фрагмента, последовательность которого мы знаем, только с тем расчетом, чтобы ДНК синтезировалась не «внутрь», а «наружу», на последовательностях, которые мы не знаем. Таким образом, нарабатываются все фрагменты ДНК, сшившиеся и, следовательно, находившиеся рядом с изучаемым фрагментом ДНК [73], [74]. В методе 5С подбирают коллекцию двух типов праймеров, у которых один конец одинаков, а другой нет. Они покрывают своими 3′- или 5′-фрагментами выбранную часть молекулы ДНК. Можно комплементарно спарить эти праймеры со сшитыми линейными или кольцевыми фрагментами из 3С, и сшить между собой праймеры, которые окажутся рядом. A потом методом ПЦР увеличить количество этих сшивок, подобрав праймеры к 3′- или 5′-концам, одинаковым у всех предыдущих праймеров [75]. И, наконец, самый последний метод — Hi-C — позволяет секвенировать всё подряд и построить карту взаимодействий всех участков со всеми. Это достигается за счет того, что при лигировании добавляются и встраиваются на липкие концы гибридных молекул нуклеотидные остатки, к которым пришит биотин. Как мы помним, биотин очень прочно взаимодействует с белком стрептавидином, это одно из самых сильных взаимодействий в молекулярной биологии. Пользуясь таким сильным взаимодействием, можно выловить часть гибридных фрагментов ДНК, куда встроился нуклеотидный остаток с биотином, на шарики с пришитым на них стрептавидином, и секвенировать гибридные участки [29]. В последнее время получил распространение метод Micro-C, который похож на Hi-C, но в котором вместо рестриктазы используется микрококковая нуклеаза. Этот фермент режет ДНК гораздо чаще рестриктазы, внося разрывы между нуклеосомами, и результаты Micro-C имеют более высокое разрешение [76]. иллюстрация Михаила Гурьева Методы Hi-C и Micro-C произвели настоящую революцию в биологии клеточного ядра. Благодаря им мы знаем, по каким принципам ДНК уложена в ядре, и какие архитектурные элементы и детали есть у генома в пространстве (см. «Хроматин в 3D»). «СкайДжин» Изучение конформации хроматина: протокол Pore-C от ONT Pore-C Технологии определения конформации хромосом (chromosome conformation capture, 3C) используются для исследования пространственной организации хроматина в ядрах клеток путем анализа взаимодействий участков генома в трехмерном пространстве. Стандартные методы секвенирования ограничивают исследования 3C из-за короткой длины прочтений, поэтому технология ONT является отличным решением для подобных задач. Решение Pore-C [29], [78–82] для секвенирования длинных прочтений позволяет изучить организацию хроматина на более высоком уровне, а также одновременно детектировать модифицированные основания. Протокол Pore-C основан на фиксации конформации хроматина в ядрах клеток, лигировании участков ДНК, находящихся близко в пространстве и дальнейшем секвенировании этих последовательностей. Компания SkyGen является эксклюзивным дистрибьютором продукции Oxford Nanopore Technologies в России и СНГ. Материал предоставлен партнером — компанией «СкайДжин» Иммунопреципитация, биотинилирование окрестности и масс-спектрометрия Чтобы определить новые белки, вовлеченные в определенный молекулярный каскад (и, следовательно, выполняющие какую-то молекулярную функцию), можно выявить неизвестные белки, взаимодействующие с уже известными, задействованными в этом каскаде. Один из способов сделать это — иммунопреципитация [83]. Для этого разрушают мембраны клеток, а из содержимого выделяют нужные части (например, ядра или митохондрии) и дробят их на отдельные молекулярные комплексы. Затем к материалу добавляют антитела или комплементарную РНК (в зависимости от того, вылавливаем ли мы из раствора белки или РНК), соединенные с шариками, и перемешивают раствор. Через некоторое время нужные молекулы, налипшие на шарики, можно извлечь и отмыть от неспецифически связавшихся молекул. Дальше белки на шариках можно разрезать протеазами на пептиды — специальными молекулярными ножницами для белков. Какие именно пептиды плавают в растворе, можно определить масс-спектрометрией [84], а по этому набору пептидов определить, какие белки антитела вытащили из клетки. Если же нас интересует РНК на шариках, то можно ее отделить от белков и секвенировать. Интересно, что специальным методом можно выявить не только белки, взаимодействующие с «нашим», но и расположенные неподалеку от него в пространстве! Такой метод появился относительно недавно и получил название «биотинилирование окрестности» (proximity labeling) [85], [86]. Суть его в том, что ген изучаемого белка соединяют с геном специального белка, биотинилирующего всё вокруг себя. Такую конструкцию доставляют в клетку, а дальше происходит следующее: часть этого химерного белка будет располагаться в том же месте клетки, что и нативный белок. А биотинилирующий всё вокруг фрагмент будет притаскиваться в это место в клетке и биотинилировать всё вокруг. Конечно, нужно учитывать, что гибридный белок будет идти и по путям биотинилирующего белка, но для этого ставят и отрицательный контроль: смотрят, что он биотинилирует в тех же клетках сам по себе, не в составе химеры. Потом биотинилированные белки можно связать со стрептавидиновыми шариками, почистить и определить масс-спектрометрией. Недавно выяснилось, что один из используемых биотинилирующих белков может биотинилировать РНК [87], а также ДНК [88]. Вероятно, метод скоро будет применяться в качестве альтернативы ChIP-seq’у и DamID для белков, которые очень подвижны на ДНК и которые очень сложно исследовать двумя известными методами (например, некоторые ремоделеры хроматина). Дело в том, что биотинилирование одним из известных белков занимает всего одну минуту, а сшивка формальдегидом — минимум 5–10 минут, не говоря уже о часах, которые занимает DamID. Поэтому на профилях таких белков, полученных ChIP-seq’ом и DamID, сложно выделить пики — места, на которых сидит изучаемый белок. А метод с биотинилирующим белком мог бы эту проблему решить и дать пики, полученные одноминутной реакцией. Данные, полученные иммунопреципитацией и биотинилированием окрестности, отвечают на разные вопросы и дополняют друг друга. В случае иммунопреципитации мы получаем список всех белков/РНК, которые прочно взаимодействуют с нашим белком, а в случае биотинилирования окрестности — список всего, что находится поблизости. Последнее может быть важно, поскольку некоторые важные взаимодействия очень слабые или короткоживущие, и иммунопреципитацией их не поймать. Оба метода рутинно используются в типичных экспериментах по эпигенетике. Благодаря им были описаны составы многих белковых комплексов и органелл. Литература От атомов к древу (рецензия); От атомов к древу (отрывок из книги); Путешествие внутрь клеточного ядра, или Системная биология хроматина; Молекулярная биология; Липидный фундамент жизни; Физическая водобоязнь; Обо всех РНК на свете, больших и малых;Всего-88